Western Blot中文一般稱為蛋白質(zhì)印跡。它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實驗方法。其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況的信息。
Western Blot與Southern印跡雜交或Northern印跡雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳 ，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素膜NC膜 ）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。其圖解為：
Western Blot顯色的方法主要有以下幾種： i. 放射自顯影 ii. 底物化學(xué)發(fā)光ECL iii. 底物熒光ECF iv. 底物DAB呈色?，F(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實驗條件的是用**種方法，目前發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光ECL。只要買現(xiàn)成的試劑盒就行，操作也比較簡單，原理如下（二抗用HRP標(biāo)記）：反應(yīng)底物為過氧化物+魯米諾 ，如遇到HRP，即發(fā)光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。
4. 蛋白樣本提取制備
蛋白樣品制備是Western Blotting的**步，更是決定WB成敗的關(guān)鍵步驟，總體原則和注意事項：
（1）盡可能提取完全或降低樣本復(fù)雜度只集中于提取目的蛋白（通過采用不同提取方法或選擇不同的試劑盒產(chǎn)品）
（2）保持蛋白的處于溶解狀態(tài)（通過裂解液的PH 鹽濃度 表面活性劑、還原劑等的選擇）
（3）提取過程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修飾等，（低溫操作，加入合適的蛋白酶和磷酸酶抑制劑）
（4）盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子（通過加入核酸酶或采取不同提取策略）
（5）樣品分裝，長期于-80 ℃中保存，避免反復(fù)凍融。
4.1細(xì)胞裂解
我們公司有針對細(xì)胞內(nèi)的不同蛋白專門的蛋白裂解液試劑盒供您選擇。
4.11細(xì)胞裂解操作方法：
（1）培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗2次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑。
（2）吸凈PBS，加入預(yù)冷的裂解液，（(1 ml per 107 cells/100mm dish/150cm2 flask; 0.5ml per 5x106 cells/60mm dish/75cm2 flask).
（3）用細(xì)胞刮子刮取貼壁細(xì)胞，將細(xì)胞及裂解液溫和地轉(zhuǎn)移**預(yù)冷的微量離心管中，
（4）4℃搖動30 min。
（5）4℃離心12,000 rpm，10 min（根椐細(xì)胞種類不同調(diào)整離心力）
（6）輕輕吸取上清，轉(zhuǎn)移**新預(yù)冷的微量離心管中置于冰上，即為蛋白樣本，棄沉淀.
4.2組織裂解
（1）用滅菌的預(yù)冷的工具分離目的組織，盡量置于冰上以防蛋白酶水解，
（2）將組織塊放在圓底的微量離心管或Eppendorf管中，加入液氮凍結(jié)組織于冰上均質(zhì)研磨，長期可保存于-80 °C。
（3）每約5 mg加入約300 μl 預(yù)冷的裂解液lysis buffer，冰浴勻漿后置于4℃搖動2小時，裂解液體積與組織樣本量有適當(dāng)比例，（**終的蛋白濃度**少達(dá)到0.1 mg/ml, 理想的蛋白濃度應(yīng)為1-5 mg/ml).
（4）4℃離心12,000 rpm，20 min，
輕輕吸取上清，轉(zhuǎn)移**新預(yù)冷的微量離心管中置于冰上，即為蛋白樣本，棄沉淀。
4.3蛋白酶和磷酸酶抑制劑
推薦購商品化蛋白酶和磷酸酶抑制劑復(fù)合試劑盒或COOKTAIL，或按下表配制：
備注：其中Sodium orthovanadate配制活化方法如下：
所有步聚均需在通風(fēng)櫥中進(jìn)行：
（1） 用雙蒸水配制100 mM 正礬酸鈉溶液.
（2）用鹽酸HCl 調(diào)**pH 9.0
（3）煮沸**溶液無色,盡量減少水分揮發(fā).
（4）冷卻**室溫
（5）再調(diào)pH ** 9.0
（6）再煮沸**無色
（7）重復(fù)上述過程,直**溶液煮沸冷卻后達(dá)pH 9.0
（8）用水定容**原體積
（9）分裝保存于- 20 °C. 溶液變黃則棄之不用.
5. 蛋白定量
Bradford 法 Lowry 法或BCA 法 （操作簡單、需分光光度計或酶標(biāo)儀），小牛血清白蛋白 (BSA) 作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果裂解液中有NP40或其它表面活性劑，則推薦使用BCA 法。三種方法或產(chǎn)品比較
列表如下：
一般的抗體只能識別抗原蛋白中的部份序列結(jié)構(gòu)（表位），因此，為使抗體能夠達(dá)到結(jié)合該表位而需要將蛋白樣本進(jìn)行變性，使之打開折疊的空間結(jié)構(gòu)，
7. 電泳
7.1 PAGE膠的制備
不同分子量的蛋白選擇不同的凝膠濃度（參考下表），原則上高分子量蛋白用低濃度膠，低分子量蛋白用高濃度膠分離。
不同濃度的凝膠的配制方見公司提夠的相關(guān)試劑盒說明書，首先配制各組分貯備液，然后分別配制濃縮膠和分離膠。
7.2蛋白分子量Marker
預(yù)染或非預(yù)染各種分子量的蛋白，用于標(biāo)示電泳中蛋白的大小和示蹤
7.3陽性對照
目的蛋白或明確表達(dá)目的蛋白的組織或細(xì)胞的蛋白提取物，用于檢驗整個實驗體系和過程的正確性有效性/特別是一抗的質(zhì)量和效率。建議使用該對照?？刹殚單墨I(xiàn)或抗體說明書選擇購買或自提該對照樣本。
7.4內(nèi)參對照
管家基因編碼的、很多組織和細(xì)胞中都穩(wěn)定表達(dá)的蛋白，用于檢測整個WB實驗過程及體系是否正常工作，并作為半定量檢測目的蛋白表達(dá)量的標(biāo)準(zhǔn)對照。必須設(shè)立。
7.5上樣與電泳
每孔上樣量為20-40 μg蛋白，使用專用槍頭或注射針頭，勿溢出加樣孔，電泳時間按電流儀說明書推薦方法使用,(1小時或過夜，取決于電壓大?。?，當(dāng)染料到達(dá)膠的底部，關(guān)電源停止電泳，膠不能存放，應(yīng)立刻進(jìn)行下一步的轉(zhuǎn)膜。
8. 轉(zhuǎn)膜與顯色（Western Blot）
8.1膠中蛋白的檢測
電泳后檢測蛋白是否遷移正確與平均，可采用銅染或考馬斯藍(lán)染色檢測，如果凝膠中的蛋白需要進(jìn)行轉(zhuǎn)膜則需可逆的銅染法，否則采用不可逆考馬斯藍(lán)法染色。
銅染法：電泳膠用蒸餾水洗數(shù)秒鐘，加入0.3 M CuCl2染色5-10分鐘，再用去離子水洗一次，在暗背景下觀察在蘭色膠背景下蛋白出現(xiàn)透明條帶，膠置于0.1- 0.25 M Tris/0.25 M EDTA pH 8.0緩沖液中漂洗脫色兩次，再置于電轉(zhuǎn)緩沖液中開始轉(zhuǎn)膜。
考馬斯藍(lán)法：用40%雙蒸水, 10% 醋酸, 50%甲醇的溶液固定膠中蛋白，考馬斯藍(lán)R-250染液（凱基產(chǎn)品）室溫染色4小時**過夜，保持搖勻，轉(zhuǎn)入67.5%雙蒸水, 7.5% 醋酸, 25%甲醇l搖勻**脫去多余的染料，蛋白被染成深藍(lán)色。
8.2蛋白轉(zhuǎn)膜
蛋白因結(jié)合SDS而帶電荷，在電場下從膠中轉(zhuǎn)**膜上，轉(zhuǎn)膜操作根椐電轉(zhuǎn)儀制造商的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)膜方式分為半干和濕轉(zhuǎn)兩種，半干式轉(zhuǎn)膜速度快，而濕式成功率高并特別適合用于分子量大于100KD的蛋白。
濕式轉(zhuǎn)膜三明治排列為：海綿/紙/膠/膜/紙/海綿，全部緊密排列，特別是膠/膜之間不能留有氣泡，三明治安放的方向確認(rèn)正確負(fù)極方為帶負(fù)電的膠里的蛋白，向正極方（膜）電遷移。標(biāo)準(zhǔn)的電轉(zhuǎn)緩沖液為1X Tris-glycine buffer 不含SDS，但加入20%甲醇，如果轉(zhuǎn)膜的蛋白分子量大于80KD，則推薦加入SDS使之終濃度為0.1%。
半干式轉(zhuǎn)膜中，三明治的排列為：/紙/膠/膜/紙，用電轉(zhuǎn)緩沖液浸濕后，直接置于電轉(zhuǎn)儀的正負(fù)極之間。膠于負(fù)極而膜置于正極。半干式的電轉(zhuǎn)緩沖液可不同于濕式的電轉(zhuǎn)緩沖液，推薦為：48 mM Tris, 39 mM glycine, 0.04% SDS, 20%甲醇，
兩類膜可供選擇：硝酸纖維素膜和PVDF膜（正電荷尼龍膜），根據(jù)不同需要選擇（下表），PVDF膜需要浸泡甲醇中1-2分鐘，再孵育于冰冷的電轉(zhuǎn)緩沖液中5分鐘，膠也需在冰冷的電轉(zhuǎn)緩沖液中平衡3-5分鐘，否則轉(zhuǎn)膜時會導(dǎo)致條帶變形。
注：大蛋白和小蛋白的轉(zhuǎn)膜
電轉(zhuǎn)移緩沖液中SDS與甲醇的平衡、蛋白的大小、膠的濃度都會影響轉(zhuǎn)膜效果，如下調(diào)整可以增加轉(zhuǎn)膜效率：
大蛋白（大于100 KD）
1．對于大蛋白而言，其在凝膠電泳分離遷移較慢，而從凝膠轉(zhuǎn)出也非常慢，因此對于這種大分子量蛋白應(yīng)該用低濃度的凝膠，8%或更低，但因低濃度的膠非常易碎，所以操作時需十分小心，
2.大蛋白易在凝膠里形成聚集沉淀，因此；轉(zhuǎn)膜時在電轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度為0.1%的SDS，以避免出現(xiàn)這種情況，甲醇易便SDS從蛋白上脫失，因此應(yīng)降低電轉(zhuǎn)移緩沖液中甲醇的濃度**10%或更低，以防止蛋白沉淀。
3.降低電轉(zhuǎn)移緩沖液中甲醇的比例以促進(jìn)凝膠的膨脹，易于大蛋白的轉(zhuǎn)出。
4．如果使用PVDF，甲醇是必需的，且轉(zhuǎn)膜前PVDF需用甲醇活化。但如果是NC膜，甲醇可以不必加入電轉(zhuǎn)移緩沖液中。
5．選擇濕式，4 ℃轉(zhuǎn)膜過夜，以取代半干式轉(zhuǎn)膜。
小蛋白（小于100 KD）
1. SDS妨礙蛋白與膜的結(jié)合，特別是對小蛋白更是如此，因此，對于小分子的蛋白，電轉(zhuǎn)移緩沖液中可以不加SDS。
2.保持20%的甲醇濃度
對于大于500KD的蛋白，請參考下述文獻(xiàn)：Bolt and Mahoney, High-efficiency blotting of proteins of diverse sizes following sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide, gel electrophoresis. Analytical Biochemistry 247,185–192 (1997).
更多的轉(zhuǎn)膜注意事項：
Ø避免用直接接觸膜，應(yīng)使用鑷子，手指上的油脂與蛋白會封閉轉(zhuǎn)膜效率并易產(chǎn)生背景污斑
Ø排列三明治時，盡量用移液器或15ml試管趕除膠與膜之間的氣泡，或?qū)⑷髦畏旁谘b有的培養(yǎng)皿中以防止氣泡產(chǎn)生，請戴手套！
Ø確認(rèn)裁剪的膜和濾紙與凝膠尺寸相同，否剛導(dǎo)致電流不能通過膜，從而轉(zhuǎn)膜無效
Ø雞抗體易于與PVDF膜和其它尼龍膜結(jié)合，導(dǎo)致高背景，請?zhí)鎿Q成硝酸纖維素膜以降低背景。
Ø膜上蛋白的檢測：麗春紅。為檢測轉(zhuǎn)膜是否成功，可用麗春紅染色，2%的麗春紅貯備液(20ML)：: 2%麗春紅(0.4克)溶于30%三氯乙酸(6克)和30%磺基水楊酸(6克)麗春紅染色工作液：2%的麗春紅貯備液1：10稀釋，即加9 倍的ddH2O染色方法：將膜放入TBST洗一次，再置于麗春紅染色工作液中,在室溫下?lián)u動染色5分鐘，大量的水洗膜直**水變清無色蛋白條帶清晰，（膜也可以用TBST或水重新洗后再進(jìn)行染色）PVDF膜需用甲醇再活化后用TBST洗后進(jìn)行封閉。
9. 膜的封閉
為防止一抗或/和二抗與膜的非特異性結(jié)合產(chǎn)生的高背景，因此需要進(jìn)行膜的封閉，
傳統(tǒng)上有兩種封閉液：脫脂奶粉或BSA，脫脂奶粉成本低但不能用于磷酸化蛋白（因脫脂奶粉含有酪蛋白，該蛋白本身就是一種磷酸化蛋白），使用脫脂奶粉會結(jié)合磷酸化抗體從而易產(chǎn)生高背景。
某些抗體用BSA封閉時因不明原因可能會產(chǎn)生比脫脂奶粉更強(qiáng)的信號，，請仔細(xì)閱讀說明書注明的注意事項和膜的特殊的封閉方法。
配制5%脫脂奶粉或BSA 溶液：每100 ml TBST中加入5 g脫脂奶粉或BSA，混勻后過濾，如不過濾會導(dǎo)致使膜污染上細(xì)微黑顆粒。
封閉時，4°C搖動，封閉1 hour ，再用TBST洗5秒，進(jìn)入下一步抗體的孵育。
10. 一抗的孵育
孵育Buffer：按抗體說明書建議的稀釋倍數(shù)，用TBST稀釋一抗，如果說明書沒有建議的稀釋倍數(shù)，則參照一般推薦的稀釋倍數(shù)(1:100-1:3000)，一抗?jié)舛冗^高會導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性條帶。
某些實驗室傳統(tǒng)上在封閉液中孵育抗體，而有些實驗室用不含封閉劑的TBST來孵育抗體，結(jié)果因抗體而異，有時兩者結(jié)果相同，有時結(jié)果不同。
注：如果不存在高背景的問題，某些抗體用含低濃度(0.5 – 0.25%)脫脂奶粉或 BSA的封閉液來,稀釋，可產(chǎn)生相對更強(qiáng)的信號條帶。
孵育時間：一抗的孵育時間可從幾小時**過夜（一般不超過18小時）不等，取決于抗體與蛋白的親和性和蛋白的含量豐度，建議使用較高的抗體稀釋倍數(shù)和較長的孵育時間來保證特異性結(jié)合。
孵育溫度：盡可能低溫孵育，如果在封閉液中孵育一抗過夜，應(yīng)在4oC進(jìn)行否則會產(chǎn)生污染而破壞蛋白（降別是磷酸基團(tuán)）。孵育一抗時需保持適當(dāng)?shù)膿u動使之均勻覆沒膜，防止結(jié)合不均勻。
11. 二抗的孵育
一抗孵育結(jié)束后，用TBST搖動洗膜數(shù)次，每次5min或更長，去除殘留的一抗。
孵育Buffer和稀釋倍數(shù)：用TBST按說明書推薦的倍數(shù)稀釋二抗，如果說明書沒有標(biāo)出稀釋倍數(shù)，則按常規(guī)的倍數(shù)稀釋(1:1000- 1:20,000)預(yù)試，二抗的濃度過高也會導(dǎo)致非特異性條帶。亦可以在封閉液中孵育二抗（和一抗），但可能在降低背景同時導(dǎo)致特異性條帶的信號也減弱，可能是封閉劑阻礙了抗體與靶蛋白的結(jié)合。
孵育時間和溫度：室溫、1-2 hours, 搖動。
二抗連接物：推薦使用二抗連接HRP，不建議連接AP堿性磷酸酶，因其不夠靈敏。
12. 顯色
顯色分為酶促底物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光法或熒光法
酶促底物發(fā)光法代表為DAB顯色法，與其它同類方法的比較如下圖所示：
而現(xiàn)在**常用的是化學(xué)發(fā)光法：HRP化學(xué)發(fā)光底物 Luminol（ECL法chemiluminescence）及其改良法，
13. 常見問題分析與解決方案
13.2其他常見問題分析
無信號
一抗和二抗不匹配
二抗需和一抗宿主的物種相同（如一抗來自兔，二抗為抗兔抗體）。
沒有足夠的一抗或二抗結(jié)合目標(biāo)蛋白
使用高濃度抗體。4°C延長孵育時間（如過夜）。
封閉劑與一抗或二抗有交叉反應(yīng)
使用溫和的去污劑如吐溫-20，或更換封閉劑（常用的脫脂奶粉、BSA、血清或明膠）。
一抗不識別待檢物種的蛋白
參照說明書，比對免疫原序列和蛋白序列以確?？贵w和目的蛋白會發(fā)生反應(yīng)，設(shè)置陽性對照。
抗原量不足
每條泳道蛋白上樣量不低于20-30?μg，使用蛋白酶抑制劑并設(shè)置陽性對照。
組織中目的蛋白含量低
濃縮使信號**大化（例如檢測核蛋白可用核裂解物）。
轉(zhuǎn)膜不充分
使用可逆染色劑如麗春紅S?檢測轉(zhuǎn)膜效果,檢查轉(zhuǎn)膜操作是否正確。PVDF?膜需預(yù)先浸在甲醇中，然后浸到轉(zhuǎn)移緩沖液中。
洗膜過度
勿過度洗膜。
過度封閉使目標(biāo)蛋白不能顯色
使用0.5%奶粉或無奶粉代替5%奶粉的抗體稀釋液，或更換封閉劑，減少封閉時間。
一抗失效
使用新鮮抗體，重復(fù)使用有效濃度會降低。
二抗受疊氮鈉抑制
避免疊氮鈉和HRP?標(biāo)記抗體一起使用。
檢測試劑盒過期和底物失活
使用新鮮的底物。
背景高
未進(jìn)行非特異性封閉或封閉不充分
延長封閉時間，考慮更換合適的封閉劑。Abcam推薦5%脫脂奶粉、3% BSA或血清封閉30?分鐘，這些可以包含在抗體緩沖液中。
一抗?jié)舛冗^高
稀釋抗體**合適濃度，以更高稀釋度抗體延長孵育時間（耗時長但特異性結(jié)合**好）。
抗體孵育溫度過高
4°C孵育。
二抗與封閉劑非特異性結(jié)合或反應(yīng)
設(shè)置二抗對照（不加一抗）。
二抗與封閉劑非特異性結(jié)合或與封閉劑反應(yīng)
在孵育和洗滌液中加入溫和去污劑如吐溫-20。脫脂奶粉含有酪蛋白，該蛋白本身就是一種磷酸化蛋白，會結(jié)合磷酸化特異性抗體而易產(chǎn)
生高背景。使用BSA代替奶粉作為封閉劑。
未結(jié)合蛋白質(zhì)洗滌不充分
增加洗滌次數(shù)。
選膜不當(dāng)產(chǎn)生的高背景
硝酸纖維素膜比PVDF膜背景低。
膜干燥
在孵育過程中防止膜變干，每一步都要保證膜有充分的反應(yīng)液，可放入攪拌子不斷攪動或輕輕振蕩使膜浸在溶液里。
多帶現(xiàn)象
細(xì)胞傳代次數(shù)過多，蛋白表達(dá)不同
使用原始未傳代的細(xì)胞株，和現(xiàn)在的細(xì)胞株一起做平行對照實驗。
體內(nèi)表達(dá)的蛋白樣本具有多種修飾形式如乙?；?、甲基化、烷基化、磷酸化、糖基化等
參考文獻(xiàn)，使用試劑使樣品去磷酸化、去糖基化來證明翻譯后的修飾。
蛋白樣本降解（蛋白質(zhì)分子量降低）
在樣品緩沖液中加入足夠的蛋白酶抑制劑。
檢測到未經(jīng)報道過的新蛋白或同一蛋白家族中具有相似表位而結(jié)構(gòu)不同的蛋白
查閱其它文獻(xiàn)報道，或BLAST搜尋，使用說明書推薦的細(xì)胞株或組織。
一抗?jié)舛冗^高，高濃度時常出現(xiàn)多條蛋白帶
降低抗體濃度和/或孵育時間。
二抗?jié)舛冗^高，高濃度產(chǎn)生非特異性結(jié)合
降低抗體濃度，加入二抗對照（不加一抗）。
抗體未經(jīng)純化
使用親和純化的抗體，減少非特異條帶。
條帶為非特異性條帶
應(yīng)用封閉多肽來區(qū)分特異性和非特異性條帶，只有特異性條帶能被封閉從而消失。
目標(biāo)蛋白形成多聚體
SDS-PAGE電泳加樣前，煮沸10分鐘而不是5分鐘，使蛋白質(zhì)解聚。
背景有不均勻的白色斑點
轉(zhuǎn)膜時膜上有氣泡或抗體在膜上分布不均
轉(zhuǎn)膜過程中盡量除去氣泡，抗體孵育時保持搖動。
背景有黑色斑點
抗體結(jié)合了封閉劑
過濾封閉劑。
深背景出現(xiàn)白色條帶
一抗或二抗加入過多
稀釋抗體的濃度。
分子量標(biāo)準(zhǔn)條帶呈黑色
抗體和分子量標(biāo)準(zhǔn)發(fā)生了反應(yīng)
在分子量標(biāo)準(zhǔn)和**個樣品之間增加一個空白條帶。
目的條帶染色過低/過高
分離不徹底
改變凝膠比例：分子量大的蛋白用低濃度膠，分子量小的蛋白用高濃度膠。
條帶“微笑”效應(yīng)
1.遷移過快
2.電泳溫度過高（改變了pH值和遷移速度）
降低遷移速度或低溫電泳（冷庫或冰上）。
相同的蛋白雜交出現(xiàn)大小不均勻條帶
制備凝膠時凝膠凝固太快，致使泳道中丙烯酰胺的比例不均勻
參照凝膠的配方，在凝膠中加入適量TEMED，放置時在凝膠頂部加入適量0.1% SDS（水稀釋）以防凝膠變干。
凝膠染色不均勻
1.細(xì)菌污染
2.抗體量不足
（1）4 °C保存抗體并使用新鮮的緩沖液浸泡凝膠。
（2）確保振蕩條件下孵育膜或抗體充分覆蓋膜。
