在電流的作用下，使蛋白質(zhì)從膠轉(zhuǎn)移**固相載體（膜）上。

膜的選擇：印跡中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龍膜、PVDF等。我們選用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理強(qiáng)度，以及具有更好的化學(xué)兼容性。 有兩種規(guī)格：Immobilon-P（0.45um）和Immobilon-PSQ(0.2um for MW<20kDa)。

A 半干法

即將凝膠夾層組合放在吸有轉(zhuǎn)印緩沖液的濾紙之間，通過(guò)濾紙上吸附的緩沖液傳導(dǎo)電流，起到轉(zhuǎn)移的效果。因?yàn)殡娏髦苯幼饔迷谀つz上，所以其轉(zhuǎn)移條件比較嚴(yán)酷，但是其轉(zhuǎn)移時(shí)間短，效率高。

1 實(shí)驗(yàn)條件的選擇

電流1mA-2mA/cm2，我們通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、膠濃度選擇轉(zhuǎn)移時(shí)間，具體可以根據(jù)實(shí)際適當(dāng)調(diào)整。

目的蛋白分子大小(kDa) 膠濃度 轉(zhuǎn)移時(shí)間

80---140 8% 1.5-2.0

25---80 10 1.5

15--40 12 0.75

<20 15 0.5

2 實(shí)驗(yàn)操作

（1）濾紙和膜的準(zhǔn)備 (在電泳結(jié)束前20分鐘應(yīng)開始準(zhǔn)備工作)。

A. 檢查是否有足夠的transfer buffer，沒(méi)有立即配制。

B. 檢查是否有合適大小的濾紙和膜。

C. 將膜泡入甲醇中，約1-2分鐘。再轉(zhuǎn)入transfer buffer中。

D. 將合適的靠膠濾紙和靠膜濾紙分別泡入transfer buffer 中。

PDVF膜在進(jìn)轉(zhuǎn)移緩沖液時(shí)，要在甲醇里面泡多長(zhǎng)時(shí)間?

PVDF是疏水性的，在轉(zhuǎn)膜緩沖液里很難浸透，甲醇處理后使更容易浸潤(rùn)。 PVDF的預(yù)處理是用甲醇浸泡活化，浸泡透之后轉(zhuǎn)入蒸餾水洗兩次。用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合。

一般5-20分鐘都有人在用。可在取膠的同時(shí)泡，估計(jì)前后5分鐘左右。效果還不錯(cuò)。以前有站友發(fā)貼，說(shuō)處理時(shí)間沒(méi)多大關(guān)系，關(guān)鍵看膜的質(zhì)量．確實(shí)是這樣的。只要讓膜完全浸透應(yīng)該就沒(méi)問(wèn)題了。

Hybond的PVDF說(shuō)明書這樣的寫的：“pre-wet the membrane in 100% methanol (10 seconds)”。 我的理解是，**少10秒鐘，多泡下也沒(méi)關(guān)系的，事實(shí)上，泡10秒的做過(guò)，10分鐘的也做過(guò)，都沒(méi)有問(wèn)題的。

（2）轉(zhuǎn)移

A. 在電轉(zhuǎn)移儀上鋪好下層濾紙。一般用三層。

B. 將膜鋪在靠膜濾紙上，注意和濾紙間不要有氣泡，再倒一些transfer buffer到膜上，保持膜的濕潤(rùn)。

C. 將膠剝出，去掉stack gel，小心的移到膜上。

D. 剪去膜的左上角，在膜上用鉛筆標(biāo)記出膠的位置。

E. 將一張靠膠濾紙覆蓋在膠上。 倒上些transfer buffer，再鋪兩張靠膠濾紙。

F. 裝好電轉(zhuǎn)移儀，根據(jù)需要選定所需的電流和時(shí)間。

G. 轉(zhuǎn)移過(guò)程中要隨時(shí)觀察電壓的變化，如有異常應(yīng)及時(shí)調(diào)整。

3 注意事項(xiàng)及常遇到的問(wèn)題：

1）濾紙、膠、膜之間的大小，一般是濾紙>=膜>=膠。

2）濾紙、膠、膜之間千萬(wàn)不能有氣泡，氣泡會(huì)造成短路。

3）因?yàn)槟さ氖杷?，膜必須首先在甲醇中完全浸濕。而且在以后的操作中，膜也必須隨時(shí)保持濕潤(rùn)（干膜法除外）。

4）濾紙可以重復(fù)利用，上層濾紙（靠膜）內(nèi)吸附有很多轉(zhuǎn)移透過(guò)的蛋白質(zhì)，所以上下濾紙一定不能弄混，在不能分辨的情況下，可以將靠膠濾紙換新的。

5）轉(zhuǎn)移時(shí)間一般為1.5 小時(shí)，( 1mA-2mA/cm2，10% gel)，可根據(jù)分子量大小調(diào)整轉(zhuǎn)移時(shí)間和電流大小。

1)在疊膜、膠、紙三明治時(shí)候，操作于盛有轉(zhuǎn)膜Buffer的大平皿中進(jìn)行，疊好后，再將三者平行轉(zhuǎn)移**轉(zhuǎn)膜裝置，切勿再移動(dòng)，因?yàn)樵赽uffer中操作，已經(jīng)完全排除了氣泡存在的可能，無(wú)需再趕氣泡

2)關(guān)于轉(zhuǎn)膜時(shí)間：半干轉(zhuǎn)的話，20 V×30min即可

B 濕法

我們基本上不用此方法，這里暫不做介紹。

C 轉(zhuǎn)移后效果的鑒定

1．染膠

用考馬斯亮蘭染色經(jīng)destain脫色后，看膠上是否還有蛋白來(lái)反映轉(zhuǎn)移的效果。

2．染膜

有兩類染液選擇，可逆的和不可逆的?？赡娴挠衟onceau-s red 、Fastgreen FC、CPTS等，這類染料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做進(jìn)一步的分析用。但是不可逆的染料，如考馬斯亮蘭、india ink、Amido.black 10B等，染色后膜就不能用于進(jìn)一步的分析。