PAGE膠上蛋白質(zhì)的銀染方法有數(shù)百種，其原理相似，具體步驟各不相同。銀染為蛋白質(zhì)的非特異性染色，呈“爆炸性”反應(yīng)模式，用于蛋白定量時(shí)準(zhǔn)確性差，但其敏感度高、簡(jiǎn)便易行，仍被廣泛應(yīng)用。下面列舉的這三種方法為常用的雙向電泳凝膠染色法，可與質(zhì)譜兼容。其中方法1敏感性**高，方法3背景**低、對(duì)比度好。
1. Blam silver staining protocol (Modified)
| 程序 | 溶液 | 時(shí)間 |
|---|---|---|
| 固定 |
40%ETOH 10%HAC |
1小時(shí) |
| 漂洗 | 30%ETOH | 2×20min |
| 致敏 | 0.02%Na2S2O3 | 1min |
| 漂洗 | H2O | 3×20Secs |
| 染色 | 0.1%AgO3(預(yù)冷) | 4℃，20mins |
| 漂洗 |
H2O H2O(更換盤子) |
3×20Secs 1min |
| 顯色 |
3%Na2CO3 0.05%甲醛 |
|
| 漂洗 | H2O | 20Secs |
| 中止 | 5%Hac | |
| 漂洗 | H2O | 3×10min |
| 貯存 | 1%Hac,4℃ |
2. EMBL Silver Staining Protocol
| 程序 | 溶液 | 時(shí)間 |
|---|---|---|
| 固定 |
50%MeOH 5%HAc |
20min |
| 漂洗 | H2O | 2hr或過夜 |
| 致敏 | 0.02%Na2S2O3 | 1min |
| 漂洗 | H2O | 2×1min |
| 染色 | 0.1%AgO3(預(yù)冷) | 20mins |
| 漂洗 | H2O | 2×1min |
| 顯色 |
2%Na2CO3 0.04%甲醛 |
|
| 中止 | 5%Hac | |
| 漂洗 | H2O | 3×10min |
| 貯存 | 1%Hac,4℃ |
3. Vorum Silver Staining Protocol
| 程序 | 溶液 | 時(shí)間 |
|---|---|---|
| 固定 |
50%MeOH 12%HAC 0.05%甲醛 |
2hr或過夜 |
| 漂洗 | 35%ETOH | 3×20min |
| 致敏 | 0.02%Na2S2O3 | 2min |
| 漂洗 | H2O | 3×5mins |
| 染色 |
0.2AgNO3 0.076%甲醛 |
20mins |
| 漂洗 | H2O | 3×5mins |
| 顯色 |
3%Na2CO3 0.05%甲醛 0.0004% Na2S2O3 |
5mins |
| 中止 |
50%MeOH 12%HAc |
|
| 貯存 | 1%Hac,4℃ |
注意事項(xiàng)：
1.應(yīng)嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行；
2.顯色前**好更換新染色盤；
3.顯色時(shí)變?yōu)辄S色或棕色后立即棄去，更換新鮮顯色液，一般來說染一塊膠應(yīng)配制500ml染液。更換2-3次；
4.市售甲醛的濃度為37%；
5.三種方法均與質(zhì)譜兼容，Blum法敏感性高，但背景呈淡黃色，EMBL法次之但背景較低，染色點(diǎn)較黑。Vorum相對(duì)不敏感，但背景清晰，信噪比高。
