一、 目的
建立SDS-PAGE電泳的測定方法,確保電泳檢測的準確性，保證電泳的安全性、有效性。
二、 范圍與權(quán)責
適用于本公司的所有成品以及中間體的分析，由化驗員負責采樣檢測。 品控主管負責審核。
三、 原理
SDS-PAGE電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進SDS,SDS會與變性的多肽結(jié)合，并使蛋白帶負電荷，由于多肽結(jié)合SDS的量總是與多肽的分子量成正比而與其序列無關(guān)，因此SDS多肽復(fù)合物在丙烯酰胺凝膠電泳中的遷移率只與多肽的大小有關(guān)，在達到飽和的狀態(tài)下，每克多肽可與1.4g去污劑結(jié)合。當分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：lgMw=k-bX。式中：Mw為分子量；X為遷移率；k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標準蛋白質(zhì)的遷移率對數(shù)分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量。
四、 實驗儀器及試劑
1. DYCZ-24DN 雙垂直
電泳儀 2. DYY-8C
電泳儀電源
3. STS-2A
脫色搖床（水平） 4. 標準蛋白Marker 5. 平皿：直徑150mm 6. TEMED:四甲基乙二胺 7. DTT:二硫蘇糖醇 8.
儲存液
①2M Tris-HCl緩沖液：稱取24.2g Tris，用50ml蒸餾水溶解后，滴加HCl調(diào)節(jié)pH**8.8，待室溫，加蒸餾水**100ml。
②1 M Tris-HCl緩沖液：稱取12.1g Tris，用50ml蒸餾水溶解后，滴加HCl調(diào)節(jié)pH**6.8，待室溫，加蒸餾水**100ml。
③10%SDS溶液：稱取10g SDS ，加蒸餾水溶解**100ml。 ④50%甘油：50ml甘油加50ml蒸餾水，混合均勻。
⑤1%溴酚藍：100mg溴酚藍，加蒸餾水**10ml，攪拌**完全溶解，水相針式過濾器過濾除去聚合的染料。 9. 工作液
①A液：30%丙烯酰胺儲存液，丙烯酰胺是一種神經(jīng)毒素，可通過皮膚被人體吸收并富集。操作時要避免皮膚接觸，并帶合適的口罩于通風櫥中進行。
②B液—分離膠緩沖液：取75ml 2M Tris-HCl緩沖液，4ml10%SDS溶液，加21ml蒸餾水，混合均勻，4℃保存數(shù)月。
③C液—濃縮膠緩沖液：取50ml 1M Tris-HCl緩沖液，4ml10%SDS溶液，，加46ml蒸餾水，混合均勻，4℃保存數(shù)月。
④10%APS：稱取1g過硫酸銨，加10ml蒸餾水溶解后，水相針式過濾器過濾分裝到EP管中，4℃保存一個月，-20攝氏度保存一年。 ⑤上樣緩沖液：稱取0.154g DTT，于10ml容量瓶中，加少量水溶解后，加 0.6ml 1 M Tris-HCl緩沖液，5ml 50%的甘油，1ml 1%溴酚藍，混合均勻后定容**刻度線。
可分裝**EP管保存，4℃保存一個月，-20攝氏度保存一年。
⑥電極緩沖液：稱取3g Tris，14.4g Gly，1g SDS**1L燒杯中，加1L蒸餾水溶解，攪拌均勻，室溫保存。
10. 染色液：稱取1g考馬斯亮藍R-250，加450ml乙醇，加100ml乙酸，加水450ml，混合均勻，室溫保存。
11. 脫色液：100ml乙醇，加100ml冰醋酸，加水800ml，混合均勻，室溫保存。
五、 操作步驟
①將平板玻璃和凹板玻璃重疊，用手將兩塊玻璃板在桌面上或是玻璃板上豎起，使兩玻璃底面平齊，從而形成膠室。
②將膠室放入主體，是凹玻璃的一面向內(nèi)。若做單面膠，另一側(cè)用單膠堵板（δ=5mm）代替。 ③插入楔形插板，用力向下按，擠緊玻璃板。
④將主體放入原位制膠器內(nèi)，手柄起立位與底座箭頭對齊，兩手同時把手柄向主體推動，直到推不動為止，然后開始旋轉(zhuǎn)手柄，聽到咔、咔兩聲，底座箭頭指向手柄1.0mm標志處，此時楔形插板已壓緊膠室，可以開始灌膠了。 2、分離膠的配制
按上表，將A液，C液，蒸餾水先加到小燒杯中，混合均勻，再添加10%APS,TEMED后，混合均勻，迅速連續(xù)灌到分離膠頂部，直**有膠溢出，隨即插入試樣格，在室溫或恒溫箱內(nèi)垂直放置10min，靜置直**完全聚合。 4、樣品的處理
將樣品與上樣緩沖液以4：1混合均勻，在金屬浴上100℃，10min，如有沉淀，可適當離心備用。 5、加樣
①在凝膠聚合后，向相反的方向擰手柄，手柄彈出。 ②將電泳儀主體從原位制膠器上取出放入電泳儀下槽中。
③將約140ml的電泳緩沖液倒入由膠室和主體形成的上槽中，使緩沖液沒過凹玻璃板。
④將約200ml的電泳緩沖液倒入下槽中 ⑤慢慢地將試樣格垂直拔出。
⑥將處理好的標準蛋白和待測蛋白樣品，按預(yù)定順序通過緩沖液小心的添加5~10μl到每個樣品孔中。 6、電泳
蓋好
電泳槽蓋，接通電泳儀電源與電泳儀之間的電泳導線，設(shè)定電壓為60V，電泳時間約為30min，直**溴酚藍指示帶經(jīng)過濃縮膠與分離膠的分界線后，設(shè)定電壓100v，電泳時間150min，直**溴酚藍指示帶接近分離膠底部，切斷電源，電泳完畢。 7、剝膠
卸下電泳膠板，用刮刀小心撬開玻璃板，使兩者分離，切除凝膠左下角以示標記。 #p#分頁標題#e#
8、染色
從玻璃板上，將凝膠小心的整塊刮到裝有染色液的平皿中，置于搖床上染色45r/min，1h。 9、脫色
從染色液中小心取出凝膠，注意不要弄破，用蒸餾水清洗幾次，轉(zhuǎn)移到裝有脫色液的平皿中，置于搖床上脫色45r/min，根據(jù)脫色情況更換脫色液，脫色過夜。 脫色后，可將凝膠拍照保存，或是將凝膠浸于水中保存一段時間。
10、繪制標準曲線
測量染料和蛋白質(zhì)區(qū)帶移動的距離，即從分離膠電泳起始**染料區(qū)帶孔洞及蛋白質(zhì)區(qū)帶中心位
置的距離。
11、標準曲線的制作
縱軸為標準蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量的對數(shù)，橫軸為對應(yīng)的遷移率，可得標準工作曲線，即可根據(jù)
遷移率測出未知蛋白的分子量。
六、 問題分析與解決辦法
1、“微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？
主要是凝膠中部凝固不均勻?qū)е拢嘁娪诒容^后的凝膠中?？梢允蛊涑浞只旌暇鶆蚝笾颇z，待其凝固完全后，再做后續(xù)實驗。 2、拖尾、紋理現(xiàn)象的產(chǎn)生？
只要是樣品的溶解效果不好，有顆粒存在，可以加樣前離心一下；電泳緩沖液時間過長，重新配制。
