核酸分子是兩性解離分子，在高于其等電點(diǎn)的電泳緩沖液(pH8.0-8.3)中，基其堿基不解離，而磷酸基團(tuán)全部解離，核酸分子因而帶負(fù)電荷，電泳時(shí)向正極遷移。瓊脂糖主要多海洋植物瓊脂中提取而來(lái)并經(jīng)糖基化修飾，為一種聚合鏈線性分了，使用瓊脂糖凝膠作為電泳支持介質(zhì)，發(fā)揮分子篩功能，使得大小和構(gòu)象不同的核酸分子的遷移率出現(xiàn)較大差異，從而達(dá)到分離的目的。瓊脂糖凝膠電泳操作簡(jiǎn)單、快速、通過(guò)調(diào)整其使用濃度，使得分辨率達(dá)到大多實(shí)驗(yàn)的要求。因此成為分離、鑒定、純化核酸分子的常用方法。 一、操作過(guò)程中要注意以下一些問(wèn)題。 1、凝膠制作 1.1 凝膠濃度
凝膠的濃度據(jù)實(shí)驗(yàn)需要而變，一般在1.8%-2.0%之間，沒(méi)有用完的凝膠可以再次融化，但隨著融化次數(shù)的增加，水分丟失也越多，凝膠濃度則會(huì)越來(lái)越高，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定。補(bǔ)水辦法：一是在容器上標(biāo)記煮膠前的刻度，煮膠后補(bǔ)充水分到原刻度；二是在煮膠前稱(chēng)重，煮膠后補(bǔ)充水**原重量。粗略一點(diǎn)的辦法是通過(guò)多次較恒定的煮膠條件得出一個(gè)經(jīng)驗(yàn)補(bǔ)水值，以保證凝膠濃度基本維持在原濃度。如果條帶要回收**好不要用回收膠。
1.2 梳板的選用
一般每個(gè)制膠模具均配有多個(gè)齒型不同的梳板。梳齒寬厚，形成的點(diǎn)樣孔容積較大，用于DNA片段回收實(shí)驗(yàn)等；相反，梳齒窄而薄，形成的點(diǎn)樣孔容積就較小，用于PCR產(chǎn)物、酶切產(chǎn)物鑒定等。回收的話還可以將幾個(gè)齒用透明膠帶粘起來(lái)，形成一個(gè)窄而長(zhǎng)的大孔以加大點(diǎn)樣量提高回收率。梳板的選擇主要是看上樣量的多少而定。一般來(lái)說(shuō)，上樣量小時(shí)盡量選擇薄的梳板制膠，此時(shí)電泳條帶致密清晰，便于結(jié)果分析。另外，每次制膠時(shí)都要注意梳齒與底板的距離**少要1mm，否則，拔梳板時(shí)易損壞凝膠孔底層，導(dǎo)致點(diǎn)樣后樣品滲漏。當(dāng)然，點(diǎn)樣孔的破壞還與拔梳板的時(shí)間和方法有關(guān)，一般凝膠需冷卻30min以上方可拔出梳板，應(yīng)急的情況下可以將成型的凝膠塊入4度冰箱中冷卻15min左右，拔梳板的方法是將制膠槽放置在
電泳槽中的電泳緩沖液中，然后垂直向上慢慢用力，因?yàn)橛幸后w的潤(rùn)滑作用，梳板易拔出且不易損壞點(diǎn)樣孔。 2、點(diǎn)樣
在樣品加入上樣緩沖液中含有甘油或蔗糖以增加密度，使樣品沉入孔底；上樣緩沖液中一般還含有兩種指示劑，溴酚蘭和二甲苯菁，用于指示樣呂的遷移過(guò)程。上樣緩沖液儲(chǔ)存液一般為6倍（10倍），表示其濃度為工作濃度的六倍。使用時(shí)上樣緩沖液應(yīng)稀釋到一倍濃度。點(diǎn)樣方法是將移液槍基本垂直對(duì)準(zhǔn)點(diǎn)樣孔，用另一只手幫助固定移液槍下端，移液槍的槍頭**進(jìn)入點(diǎn)樣孔即可將樣品注入孔內(nèi)。上樣量的多少根據(jù)跑膠的目的而不同，一般直接跑DNA時(shí)量**少，跑一般的分子標(biāo)記適中，回收時(shí)可以都加進(jìn)去。**后根據(jù)擴(kuò)增條帶的大小點(diǎn)上適合的DNA Maker。 3、電泳
將
電泳儀的正極與
電泳槽的正極相連，負(fù)極與負(fù)極相連，每次電泳時(shí)都要檢查一下電極方向，以免白干（新手來(lái)做時(shí)可能就有這樣的情況發(fā)生）。核酸帶負(fù)電荷，從負(fù)極向正極移動(dòng)。
電泳槽中電泳緩沖液與制膠用電泳緩沖液應(yīng)相同，電泳緩沖液剛好浸過(guò)膠為好。電泳緩沖液濃度太大則電流加大，凝膠發(fā)熱，易使DNA降解。電泳早所加電壓一般不超過(guò)5v/cm（正負(fù)電極之間的距離，而不是凝膠的長(zhǎng)度）。電泳時(shí)間一般為30-60min，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要也可作適當(dāng)調(diào)整。電壓增高，電泳時(shí)間縮短，核酸條帶相對(duì)來(lái)說(shuō)不夠整齊，不夠清晰；相反，電壓降低，電泳時(shí)間較長(zhǎng)，條帶會(huì)相對(duì)的清晰。另外，如果電泳后樣品泳支很慢或者沒(méi)移動(dòng)可能是由于擋板沒(méi)有拿開(kāi)。
附 EB作用原理：觀察瓊脂糖凝膠中DNA**常用的方法是利用熒光染料溴化乙錠進(jìn)行染色，溴化乙錠含有一個(gè)可以嵌入DNA堆積堿基之間的一個(gè)三環(huán)平面基團(tuán)。它與DNA的結(jié)合幾乎沒(méi)有堿基序列特異性。在高離子強(qiáng)度的飽和溶液中，大約每2.5個(gè)堿基插入一個(gè)溴化乙錠分子。當(dāng)染料分子插入后，其平面基團(tuán)與螺旋的軸線垂直并通過(guò)范德華力與上下堿基相互作用。這個(gè)基團(tuán)的固定位置及其與堿基的密切接近，導(dǎo)致與DNA結(jié)合的染料呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率比游離溶液中染料有所增加。DNA吸收254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結(jié)合的染料本身吸收302nm和366nm的光輻射。這兩種情況下，被吸收的能量在可見(jiàn)光譜紅橙區(qū)的590nm處重新發(fā)射出來(lái)。由于溴化乙錠-DNA復(fù)合物的熒光產(chǎn)率比沒(méi)有結(jié)合DNA的染料高出20-30倍，所以當(dāng)凝膠中含有游離的溴化乙錠（0.5ug/ml）時(shí)，可以檢測(cè)到少**10ng的NDA條帶。
