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聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）涉及的步驟

  1. 樣品制備

 

  • 樣品可以是任何包含蛋白質(zhì)或核酸的材料。
  • 如果需要，可以將分析樣品與化學(xué)變性劑混合，通常將SDS用于蛋白質(zhì)，將尿素用于核酸。
  • SDS是一種陰離子去污劑，可使二級和非二硫鍵連接的三級結(jié)構(gòu)變性，并根據(jù)其質(zhì)量成比例地對每種蛋白質(zhì)施加負(fù)電荷。尿素打斷核酸堿基對之間的氫鍵，使組成鏈退火。將樣品加熱到至少60°C會進一步促進變性。
  • 可以將跟蹤染料添加到溶液中。它通常具有比分析物更高的電泳遷移率，以允許實驗人員在電泳過程中跟蹤溶液通過凝膠的過程。
  1. 聚丙烯酰胺凝膠的制備
  • 凝膠通常由丙烯酰胺，雙丙烯酰胺，可選的變性劑（SDS或尿素）和pH值已調(diào)整的緩沖液組成。
  • 出于特殊目的，可以改變雙丙烯酰胺與丙烯酰胺的比例，但通常為35的約1份。凝膠的丙烯酰胺濃度也可以改變，通常在5％至25％的范圍內(nèi)。
  • 較低百分比的凝膠更適合解析分子量非常高的分子，而解析較小的蛋白質(zhì)則需要更高百分比的丙烯酰胺，
  • 凝膠通常在凝膠澆鑄機中的兩個玻璃板之間聚合，并在頂部插入梳子以形成樣品孔。
  • 凝膠聚合后，可以將梳子移開，并準(zhǔn)備進行電泳。
  1. 電泳法
  • PAGE中使用各種緩沖液系統(tǒng)，具體取決于樣品的性質(zhì)和實驗?zāi)康摹?/li>
  • 用于陽極和陰極的緩沖劑可以相同或不同。
  • 在凝膠上施加電場，使帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)或核酸從負(fù)離子向正電極（陽極）穿過凝膠遷移。
  • 根據(jù)它們的大小，每個生物分子在凝膠基質(zhì)中的移動方式不同：小分子更容易穿過凝膠中的孔，而大分子則更困難。
  • 凝膠通常運行幾個小時，盡管這取決于施加在凝膠上的電壓。
  • 在設(shè)定的時間后，生物分子將根據(jù)其大小遷移不同的距離。
  • 較小的生物分子沿凝膠向下移動的距離較大，而較大的生物分子則保持更靠近起點。
  • 因此，可以根據(jù)大小大致分離生物分子，其大小主要取決于變性條件下的分子量，但也取決于天然條件下的高階構(gòu)象。
  1. 偵測
  • 電泳后，可對凝膠進行染色（對于蛋白質(zhì)，最常見的是考馬斯亮藍(lán)或放射自顯影；對于核酸，溴化乙錠；對于銀染，則可以），以使分離的蛋白質(zhì)可視化，或者進行進一步處理（例如Western blot） ）。
  • 染色后，不同種類的生物分子在凝膠中顯示為不同的條帶。
  • 通常通過在凝膠中的另一條泳道中運行已知分子量的分子量大小標(biāo)記物來校準(zhǔn)凝膠并通過比較相對于標(biāo)記物的移動距離來確定未知生物分子的近似分子量。
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