在開發(fā)特定細(xì)胞系的培養(yǎng)條件時(shí)，需要考慮許多參數(shù)。我們都知道pH平衡，氧氣水平和血清濃度是導(dǎo)致培養(yǎng)成功或失敗的重要變量。然而，包括與細(xì)胞需要相匹配的解離方法的亞培養(yǎng)方案同樣重要。考慮到這一點(diǎn)，我們將審查一些常見的解離實(shí)踐背后的原理，以幫助您根據(jù)細(xì)胞系的特定性質(zhì)定制您的方法。
懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞易于亞培養(yǎng)。只要將細(xì)胞稀釋到合適的新鮮培養(yǎng)基中，然后用完它們的營養(yǎng)供應(yīng)，它們就會(huì)很好。另一方面，以單層生長(zhǎng)的細(xì)胞彼此之間以及與培養(yǎng)皿發(fā)生蛋白質(zhì)接觸。必須先打破這些細(xì)胞，然后將細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)基中，旋轉(zhuǎn)并重新鋪板。因此，必須特別考慮確保解離條件破壞細(xì)胞接觸而不殺死細(xì)胞。
在決定解離條件時(shí)，研究者應(yīng)考慮細(xì)胞產(chǎn)生的鍵的類型。一些貼壁細(xì)胞系僅產(chǎn)生微弱的接觸，可以通過簡(jiǎn)單地將培養(yǎng)瓶撞擊在您的手掌上，或通過將燒瓶輕敲在臺(tái)面上來破壞。其他貼壁細(xì)胞系，特別是來自上皮細(xì)胞的貼壁細(xì)胞系，可形成強(qiáng)大的多蛋白質(zhì)緊密連接，只能通過酶消化破壞; 在這些情況下，經(jīng)常使用胰蛋白酶（絲氨酸蛋白酶）。來自上皮的細(xì)胞也可以表達(dá)鈣粘蛋白，其介導(dǎo)非常強(qiáng)的鈣依賴性粘附物或橋粒連接。在這種情況下，可能需要添加鈣螯合劑（如EDTA）來螯合鈣，以有效地解離細(xì)胞。
為了在解離后優(yōu)化細(xì)胞活力，反應(yīng)條件應(yīng)與細(xì)胞接觸的強(qiáng)度相匹配。例如，如果標(biāo)準(zhǔn)胰蛋白酶/ EDTA消化（通常0.05％-0.5％）不能有效消化細(xì)胞鍵（在10-15分鐘內(nèi)），則可能難以在細(xì)胞開始死亡之前從細(xì)胞中除去細(xì)胞，并且細(xì)胞活力將受到不利影響。在這種情況下，可能需要更高濃度的胰蛋白酶/ EDTA或其他酶，例如膠原酶。另一方面，如果反應(yīng)太苛刻，細(xì)胞可能裂解或丟失重新附著到板上所需的表面蛋白質(zhì)，并且任一情況都將導(dǎo)致活力降低。此外，裂解的細(xì)胞釋放基因組DNA，導(dǎo)致活細(xì)胞結(jié)塊，使存活細(xì)胞更難重新培養(yǎng)，并且需要添加DNase。
如果您已將反應(yīng)強(qiáng)度與細(xì)胞系的粘附特性相匹配，但您的細(xì)胞仍難以去除，您可能會(huì)發(fā)現(xiàn)問題在于細(xì)胞準(zhǔn)備解離的方式。在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中可能存在抑制胰蛋白酶的元素，例如血清，但是這可以通過在添加解離試劑之前用Dulbecco's PBS（不含鈣或鎂）簡(jiǎn)單地沖洗細(xì)胞一次或兩次來克服。也可能是細(xì)胞保持融合的時(shí)間過長(zhǎng)。在這些條件下，細(xì)胞可能會(huì)形成特別強(qiáng)的細(xì)胞 - 細(xì)胞和細(xì)胞 - 表面連接，這些連接特別難以破碎。出于這個(gè)原因，以及培養(yǎng)物的整體健康狀況，建議細(xì)胞在融合之前進(jìn)行傳代（即，
通過對(duì)解離試劑的工作原理的基本了解，研究人員可以開發(fā)出一種優(yōu)化的方案，該方案同時(shí)考慮細(xì)胞粘附性的強(qiáng)度和質(zhì)量。優(yōu)化的細(xì)胞解離方案將確保成功的傳代培養(yǎng)并延長(zhǎng)培養(yǎng)細(xì)胞的壽命。
Carolyn Peluso博士是ATCC的技術(shù)作家和細(xì)胞生物學(xué)專家。
